摘要 　目的:探讨力竭运动后不同时相心肌连接蛋白 43 Cx43 分布模式及含量的改变。方法:90 只健康成年雄性 SD大鼠 ,分为一次力竭运动组和 2 周反复力竭运动组及安静对照组 ,运动组采用游泳运动方式分别于力竭运动后即刻、6 小时、12 小时及24 小时取材,应用免疫荧光技术和图像分析方法对大鼠心肌 Cx43 分布及含量的改变进行研究。结果:一次力竭运动和反复力竭运动后各时相组心肌 Cx43 分布模式发生明显改变 ,由端对端连接为主转变为侧对侧连接为主。一次力竭和反复力竭运动后各时相组左、右心室 Cx43 含量都显著低于安静对照组 P <0105 。力竭运动后各时相组左、右心室cx43 含量在两种运动形式之间无显著性差异 p>0105 。结论:一次力竭运动和反复力竭运动均可造成心肌 Cx43 的降解以及分布模式的改变 ,这可能是运动性心律失常的结构基础。

      关键词 　力竭运动; 心肌微损伤; 连接蛋白43

 

 

      Abstract 　Objective Inorder to investigate the changes in distribution and content of connexin 43 in myocardial tissue after exhausted exercise at different time points. Methods Ninety male Sprague - Dawley rats were divided into sedentary control group , single bout of exhausted exercise groups and 2 - week exhausted exercise groups. Rats were killed at 0h , 6h , 12h and 24h after exhausted exercise. Immunofluorescence technique and image - analysis method were used to study the changes in distribution and content of Cx43 in myocardial tissue. Results After single bout of exhausted exercise and 2 - week exhausted exercises, myocardial Cx43 distribution pattern at each time point revealed a remarkable change: from end - to - end distribution to side - to - side distribution predominantly. After single bout of exhausted exercise and 2 - week exhausted exercises, left ventricular and right ventricular myocardial Cx43 content at each time point was remarkable lower thancontrol group P < 0105 . after exhausted exercise , left ventricular and right ventricular myocardial cx43 content at each time showed no remarkable difference between two different exercise forms p>0105 .Conclusion Single bout of exhausted exercise and 2 - week exhausted exercise could result in degradation and change in distribution pattern of myocardial Cx43 , probably contributing to exercise - induced arrhythmia structurally.

      Key words　exhaustive exercise , heart micro - injury, connexin 43

 

      剧烈运动特别是超长时间的反复大强度运动和力竭运动导致机体心脏功能方面的严重医学问题已成为人们日益关注的焦点。 缝隙连接是直接连接邻近心肌细胞的跨膜通道 ,是心肌细胞间进行物质交换和信息交流的唯一通道 ,其结构的破坏可导致心电活动和心肌收缩功能的异常。心肌连接蛋白 43 Cx43 是十余个组成缝隙连接的连接蛋白家族成员中的一个 ,是心室肌中表达最多的连接蛋白。有学者研究发现 ,在心肌梗死的边缘地带 ,缝隙连接从细胞的端对端连接处转换到细胞的侧面,而且 Cx43 的数量也下降[1- 3] ;而另外的学者则发现缺血而非梗死的心肌组织亦有Cx43的降解和分布的改变[4 – 6]。在对于心律失常的研究中发现 ,在各种心脏疾病的心肌组织中都有类似的缝隙连接的改变 ,缝隙连接的分布模式的改变和数量的下降造成心肌细胞间电耦联的障碍从而引起心律失常[7 – 9]。

本研究建立了力竭游泳运动实验动物模型,观察实验大鼠在力竭运动后即刻、6 小时、12 小时和24 小时4个时相点心肌 Cx43 分布及含量的变化,试图为运动性心律失常发生机制的探讨提供实验依据[7 – 9]。

1 材料与方法

1.1 实验动物和分组

      健康雄性成年 SD 大鼠 90 只 维通利华公司提供 ,体重260 ±8g。大鼠随机分为9 组 ,其中一次力竭4 组 即刻、运动后 6h、12h 和 24h ,2 周反复力竭4组 即刻、运动后 6h、12h 和 24h ,对照 1 组 ,每组10 只。各组大鼠初始体重无显著性差异 P >0105 。国家标准啮齿动物饲料喂养 ,自由饮食。饲养环境为室温20 ±2 ℃,光照时间12 小时 ,相对湿度

40 %～55 %。

1.2 　实验方法

1.2.1 力竭游泳运动

       采用 PVC 特制泳池 ,规格为 116m ×018m ×1.2m,内壁光滑 ,水深约 60cm,超过大鼠身长 2 倍 ,控制水温在 30～33 ℃。运动组大鼠进入动物房后首先适应 3 天 ,然后进行 2 天适应性游泳运动20min/次 。反复力竭运动组每天 1 次力竭游泳运动 ,大鼠尾部负重体重的 3 %,每周运动 6 次 ,共 2周 ,每次运动时间不少于 2 小时;每次运动后 ,迅速用干毛巾擦干水分 ,电吹风吹干后 ,放回笼中休息;末次力竭运动后取材 ,力竭标准参照 Thomas 的报道[10] ,即大鼠连续沉入水中超过 10 秒 ,捞出后置于平面不能完成翻正反射。一次力竭运动组饲养两周后与反复力竭组同时进行一次性游泳运动 ,同样尾部负重为体重的 3 %,直至力竭。安静对照组不运动 ,与运动组同时取材。

1.2.2 　大鼠心肌取材

      一次和反复力竭运动组分别于运动后即刻、6h、12h、24h取材。大鼠腹腔注射 10 %水合氯醛 1ml/100g体重 麻醉后 ,开胸后迅速取出心脏 ,经灭菌生理盐水清洗后 ,滤纸吸干并称重 ,然后迅速垂直于心脏长轴切取心肌组织 ,滴加 OCT包埋剂后置于液氮冷冻20 秒后转入冰冻切片机恒温箱 ,切取7μm厚的冰冻切片置于 - 70 ℃超低温冰箱备用。

1.2.3 　心肌冰冻切片的免疫荧光染色

       由于 Cx43 在心肌细胞膜上表达 ,为了更好地定位 ,采用双荧光标记 ,用红色荧光标记细胞膜 ,绿色荧光标记 Cx43 ,具体步骤如下: 1 将 - 70 ℃超低温冰箱保存的冰冻切片取出 ,室温复温 30 分钟后入4 ℃丙酮固定 10 分钟 ,PBS 漂洗 5 分钟 ×3次; 2100μg/ml 的得克萨斯红标记的麦芽凝集素 美国 Invitrogen公司 室温孵育 45min ,经 PBS漂洗 5 分钟 ×3 次; 3 10 %正常山羊血清封闭 ,室温孵育10 分钟;4 倾去血清 ,勿洗 ,滴加1∶50 稀释的兔抗大鼠 Cx43美国 Zymed 公司 ,4 ℃过夜 ,PBS 漂洗 5 分钟 ×3次; 5 滴加 1∶100 稀释的 FITC 标记羊抗兔 IgG,37 ℃孵育1 小时 ,PBS漂洗 5 分钟 ×3 次; 6 60 %的缓冲甘油封片。

1.2.4 免疫荧光图像的采集和分析

      实验使用Leica AS MDW多维成像工作站采集免疫荧光图像 ,所有图像均以同一曝光时间及相同条件采集。每张切片左、右心室各随机选取心肌纵切视野5 个 ,将数字化图像储存于计算机。应用JD801 形态学图像分析系统进行图像分析 ,测定 Cx43 的积分光密度 intergrated optical density, IOD ,以 IOD的大小代表 Cx43 量的多少 ,对其进行定量分析。

1.2.5 统计学处理

      所有数据均用 SPSS1210 软件包统计分析。组间进行单因素方差分析 ,结果均以平均数 ±标准差表示 , P <0105 为显著性水平 , p <0101 为非常显著性水平。

2 结果

2.1 各组大鼠心肌 Cx43 免疫荧光图像

      图1 为正常心室肌纵切图 ,黄色或绿色的短杆状或小斑点状荧光斑代表Cx43 ,可见有Cx43 分布于心肌细胞的端对端连接处 闰盘 和侧对侧连接处 ,尤以端对端连接处的 Cx43 荧光斑面积大、亮度高。一次力竭运动和反复力竭运动各时相组与安静对照组比较,荧光斑的数量、面积和亮度均低于对照组,尤其在闰盘处的荧光斑,这种差异更明显;而且荧光斑的分布模式有明显变化,力竭运动后在心肌纤维端对端连接处的荧光斑的数目有所减少,侧对侧连接处的荧光斑差异不明显,也就是说心肌 Cx43 的分布由端对端连接处占优转变为以侧对侧连接处分布为主（图2、图3）。左、右心室之间对比未见明显差异。

2.2 大鼠心肌 Cx43 的免疫荧光图像定量分析

2.2.1　一次力竭运动后不同时相大鼠心肌 Cx43 的含量

       如表1 所示 ,一次力竭运动后各时相组左心室Cx43含量均显著低于安静对照组 P < 0105 ,并且运动后各时相呈先下降后上升再下降的趋势 ,运动后12 小时组显著高于运动后即刻组 p < 0101 ,其余各时相组之间无显著性差异 p>0105 。一次力竭运动后各时相组右心室 Cx43 含量均显著低于安静对照组 P < 0101 ,并且运动后各时相呈先下降后上升再下降的趋势 ,但各时相组之间无显著性差异 （p>0105 表1） 。

2.2.2 反复力竭运动后不同时相大鼠心肌 Cx43 的含量

        如表1 所示 ,反复力竭运动后各时相组大鼠左心室 Cx43 含量均显著低于安静对照组（ P < 0101 ）,运动后各时相呈先下降后上升的趋势 ,但各时相组之间无显著性差异。

        反复力竭运动后各时相组大鼠右心室 Cx43 含量均显著低于安静对照组 P < 0101 ,运动后各时相呈先下降后上升的趋势 ,但各时相组之间无显著性差异（ p>0105 表1 ）。

2.2.3 两种不同力竭运动后左、右心室 Cx43 含量比较

      一次力竭运动后12 小时组左心室 Cx43 含量高于反复力竭运动后 12 小时组 ,但无统计学意义（P>0105） ,在运动后即刻组、运动后 6 小时组和运动后24 小时组 ,右心室 Cx43 含量在不同形式运动中也无统计学差异（ P>0105 表1 ）。

一次力竭运动后 6 小时组右心室 Cx43 含量高于反复力竭运动后6 小时组 ,但无统计学意义 P >0105 ,而在运动后即刻组、运动后 12 小时组和运动后24 小时组右心室 Cx43 含量在不同形式运动中并没有统计学差异 （P >0105 表1） 。

3 讨论

      研究发现[11-13] ,反复进行的持续大强度运动和急性力竭运动可对机体产生不利影响 ,常导致运动性疲劳与损伤的发生 ,尤其是运动性心肌微损伤。心肌的损伤可直接影响执行心肌特殊功能的蛋白质的表达异常 ,造成心肌功能的异常。王东辉等研究发现[14] ,力竭运动引起的心肌损伤表现为心肌脂质过氧化加强 ,钙离子超载 ,提示此运动可能导致缺血再灌注损伤。这种损伤在 6 小时的时相较严重 ,24小时后有所减轻 ,这些特点与临床上的缺血再灌注损伤相似。由于运动性心肌损伤类似于缺血再灌注损伤 ,那么运动后的心肌病理表现很可能存在不同时相的差异 ,所以本研究选择力竭运动后即刻、6 小时、12 小时和24 小时4 个时相研究心肌连接蛋白43的改变,以期更客观的反映力竭运动对心肌 Cx43 的影响。本研究结果显示,反复力竭运动后 Cx43 含量有先下降后上升的变化规律,运动后 6 小时最低,但各时相之间的差异无统计学意义。一次力竭运动后心肌Cx43含量在运动后即刻最低,随后逐渐上升。缝隙连接是存在于相邻细胞间的一种由特殊膜蛋白通道组成的、具有亲水性的特殊低阻抗区域 ,是细胞间直接交换物质进行信息通讯的唯一途径 ,许多组织细胞上都有缝隙连接的存在 ,几乎存在于哺乳动物所有的组织和细胞中 ,在细胞生长发育及分化过程中起重要作用[15]。相邻细胞通过缝隙连接进行信息和物质能量的交换 ,对细胞的新陈代谢、内环境稳定、增殖和分化等生理过程起着重要的调控作用。连接蛋白 43 Cx43 是十余个组成连接蛋白保守家族的成员中的一个 ,也是心肌细胞中分布最多的连接蛋白。在心肌细胞中 ,缝隙连接的活动具有全或无现象 ,细胞间收缩功能的协调是通过缝隙连接来完成的。利用 Cx43 基因的定标突变技术 ,发现突变型杂合子小鼠 Cx43( - / +) 较野生型 Cx43(+/ + )心室外膜的电传导速度降低 30 %～40 %,QRS波复极时间明显延长[16]。在体外培养的大鼠心肌细胞中 ,随着细胞间的缝隙连接增多 ,细胞由不规则收缩趋向同步收缩 ,所以缝隙连接可以协调细胞间活动的一致性。有研究者通过闭塞小鼠冠状动脉左前降支诱发急性缺血实验发现 ,杂合子 Cx43（+/ - ）小鼠快速自发性室性心律失常的发生率超过纯合子 Cx43 +/ + 小鼠的2 倍 ,且发作的时间更长[17]。

      心肌缺血可以通过多种机制诱发心律失常 ,以往的研究多集中于心肌细胞的兴奋性异常 ,近年的研究表明 ,心脏缝隙连接通道结构和功能异常所致的细胞间电耦联障碍是缺血性心律失常的另一重要原因[1 – 5]。在长期的对于心律失常的研究中人们发现 ,各种心脏疾病的心肌组织中都有缝隙连接的改变 ,人们把这种改变称为缝隙连接的重构。缝隙连接的重构造成心肌细胞间电耦联的障碍 ,而这种障碍可以造成心肌细胞兴奋性的不均一、电活动的有序性改变、传导速度的减慢和不均一、电传导各向异性的改变等 ,使心脏电活动的整体性异常从而引起心律失常。心肌缺血及心肌梗死后 ,心律失常是最常见并且是潜在的具有生命危险的并发症。大量的研究发现[1 – 4],缺血心肌及梗死区周围的心肌与正常心肌比较 ,缝隙连接的数量和分布都发生了不同程度的改变。Peters 等 通过对狗心肌梗死灶心外膜下边缘区存活心肌的研究发现 ,Cx43 紊乱分布于细胞的侧面 ,在未能诱发持续室性心动过速的犬心上 ,这种紊乱分布从梗死瘢痕区往心外膜延伸 ,但心外膜下最表层心肌的 Cx43 分布尚基本正常 ,而在能诱发持续室性心动过速的犬心上 ,可发现心外膜下梗死边缘区存在全层心肌 Cx43 均分布紊乱的部位,通过标测发现该部位正是折返环路的共同通路所在的位置。该研究直接证明了Cx43 的分布紊乱为折返的重要原因 ,从分子水平阐明了心律失常发生的解剖学基础。对于缺血而非梗死的缺血心肌的研究同样证明了 Cx43 的表达和分布的改变是缺血性心肌电重构和心律失常的结构基础。李玉光等[4] 在对急性心肌缺血 Cx43 迅速降解的非均一性研究中发现 ,急性短时间心肌缺血时 Cx43 已开始大量降解 ,缺血区的各局部及各层面 Cx43 降解程度呈明显不均一。而在对急性心肌缺血时Cx43 降解对传导速度影响的研究中发现缺血心肌各局部的传导速度明显不均一 ,某些区域出现持久的传导阻滞 ,而这些阻滞区域的心肌 Cx43 均出现严重的降解, 提示 Cx43的严重降解是心肌缺血时局部区域持久传导阻滞的重要解剖学基础[5]。可见 Cx43 的降解造成心肌组织传导速度的下降 ,降解的不均一将造成传导速度的不均一 ,而严重的降解将导致持久的传导阻滞 ,并成为诱发折返性心律失常发生的重要原因。

      本研究中 ,一次力竭运动和反复力竭运动后各时相组左、右心室肌 Cx43 的分布模式和含量都发生了改变[4 ,5],并且与文献报道 的缺血心肌的改变一致 ,即心肌 Cx43 在力竭运动后发生了降解并且其分布模式由运动前的端对端连接为主转变为运动后的侧对侧连接为主。Cx43 的降解使缝隙连接的数目下降 ,缝隙连接的数目下降又会导致电传导速度的减慢和不均一 ,而其分布部位的变化会使电传导在横向与纵向上的传播特点遭到破坏 ,即破坏了心肌细胞均匀的各向异性的特点 ,从而使心肌电活动形成间断传导 ,折返易于形成 ,进而造成心律失常。力竭运动所造成的心律失常如果伴随有心脏疾病 ,则可能使原有的心脏疾病加重而导致心功能的衰竭或者诱发更加严重的心律失常 ,两种情况均可能导致运动性猝死的发生。

4 　总结

      一次力竭运动和反复力竭运动均可造成心肌连接蛋白43 的降解 ,并且在心肌细胞不同的部位其降解的程度不同 ,即 Cx43 在侧对侧连接处的降解较少而在闰盘处的降解更为显著 ,这使得 Cx43 在心肌细胞的分布模式发生了改变。力竭运动后心肌 Cx43的上述改变可能是运动性心律失常的结构基础。

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